(GGGGS) n 连接子截短现象的发现与机制--文献精读223

Discovery and investigation of the truncation of the (GGGGS)n linker and its effect on the productivity of bispecific antibodies expressed in mammalian cells

(GGGGS) n 连接子截短现象的发现与机制探究及其对哺乳动物细胞表达双特异性抗体产量的影响

摘要

蛋白质工程是设计与改造治疗性蛋白的重要手段，可提升药效、增强安全性、降低免疫原性并优化递送效率。融合蛋白是一类重要的治疗用生物制品，通常需要合适的连接子串联不同功能结构域，以实现预期生物学功能。GGGGS 串联连接子 [(G4S)ₙ]凭借优异的柔性与抗蛋白酶降解特性，被广泛应用于蛋白质改造研究。本研究在一款双特异性抗体中，发现该类连接子存在非预期截短现象，严重影响产品生产稳定性与质量。本研究以携带5×G4S连接子的双特异性抗体为研究对象，精准定位了连接子的截短位点。结果表明：密码子优化可改善 (G4S)ₙ连接子高度重复序列、高 GC 含量带来的负面影响，将截短比例由 5%–10% 降至 1%–5%；同时，在哺乳动物细胞表达体系中，缩短连接子长度（3×G4S、4×G4S）可大幅降低截短发生概率。本研究进一步探究并讨论了短链 G4S 连接子对双特异性抗体表达产物生物活性与纯度的影响。

引言

目前获批上市的治疗性蛋白药物（尤以单克隆抗体为主）数量持续增长，另有大量候选分子处于临床前及临床研发阶段。科研人员持续通过蛋白质工程改造策略，优化重组蛋白的药效、靶向特异性、结合能力、价态与药代动力学特征，同时提升用药安全性、降低免疫原性。

融合蛋白由多个功能结构域组成，通常需要 1 个或多个间隔 / 连接子序列实现结构域串联，保障蛋白正确折叠；若无连接子直接融合，往往会导致蛋白表达量低、生物活性下降或错误折叠等问题。

(G4S)ₙ是目前应用最广泛的经典柔性连接子，因高柔性与抗酶解特性成为通用型连接元件。研究中可通过调整 G4S 重复单元数量，灵活调控连接子长度，平衡相邻结构域的空间距离与柔性，促进分子间相互作用。该连接子可形成柔性环区，适用于各类重组融合蛋白构建，实现多靶点结合与多结构域组装。

本研究报道了一款 IgG 型融合蛋白（mAb901）存在两种缺陷型变体，分子量分别缺失 630 Da、1260 Da，经鉴定为5×G4S 连接子序列截短所致。研究证实：在双特异性抗体早期药物研发阶段，合理减少 G4S 重复单元数量，可有效规避 GS 类柔性连接子的自发截短问题。

材料与方法

试剂与酶

胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、牛肠源性碱性磷酸酶购自西格玛奥德里奇；基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；细胞、培养基、补料等全套表达体系耗材购自美国赛默飞世尔；N - 糖苷酶 F 购自罗氏诊断。

蛋白表达与纯化

分别采用 CHO、HEK293 细胞，结合摇瓶培养体系与 ExpiCHO 转染试剂盒、稳定 CHO-K1 细胞株构建技术，完成 mAb901 蛋白表达。通过 14 天补料分批培养，评估不同长度连接子变体的表达水平；采用蛋白 A 亲和层析纯化目的蛋白。

补料分批培养

采用 14 天连续补料培养工艺进行蛋白表达；细胞初始接种密度为1×106个 /mL，培养环境 36 ℃、5% CO₂；培养第 4 天起，隔日添加 5%（体积比）补料培养基，并下调培养温度至 32 ℃；培养至第 14 天或细胞活力低于 80% 时终止培养并收获细胞上清。

表达产量检测

采用高效液相色谱仪测定培养上清蛋白滴度；细胞培养液 1000×g 离心 5 min，取上清上机检测；参考已发表文献方法计算比生产速率。

完整蛋白分子量检测

蛋白样品经含 4 M 尿素、pH 7.6 磷酸盐缓冲液配制的 40 mM 二硫苏糖醇还原处理；采用 UPLC - 串联质谱联用系统开展分析，配套 C4 脱盐柱与苯基色谱柱进行分离；依托质谱软件完成原始图谱反卷积，计算完整蛋白相对分子质量。

胰蛋白酶肽图分析

参考已有文献方法完成蛋白还原与烷基化处理；样品经尿素、三羟甲基氨基甲烷缓冲体系配制的胰蛋白酶，25 ℃酶解 8 h；酶解 6 h 时加入 N - 糖苷酶 F 去除糖基化修饰；酶解产物通过 C18 色谱柱、乙腈 - 水梯度洗脱，结合液质联用系统完成检测。

质谱肽段鉴定

使用生物制药质谱分析软件解析肽图峰组分；通过提取离子流图评估蛋白修饰比例；采用轨道阱质谱仪的数据依赖采集模式，获取二级质谱图谱，分别设定碰撞诱导解离、电子转移解离参数，完成肽段碎片断裂与鉴定。

T 载体构建

采用天根基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA；依托 RNA 提取试剂盒与反转录试剂盒合成 cDNA；使用宝生物 pMD 19-T 载体克隆试剂盒完成 T 载体连接与构建。

RNA 二级结构预测

利用 mfold 在线 RNA 折叠预测网站，完成序列 RNA 二级结构模拟，同步获取不同结构对应的自由能（ΔG）参数。

体积排阻色谱（SEC）检测

蛋白 A 纯化后的样品，通过高效液相色谱结合体积排阻色谱法分析聚集体；上样量 50 μg，流动相为磷酸盐 - 氯化钠缓冲液，检测波长 280 nm，恒定流速洗脱。

还原型 SDS 毛细管电泳（CE-SDS）

经体积排阻色谱纯化的蛋白样品，加入 β- 巯基乙醇还原处理，高温变性离心后，采用毛细管电泳系统进行分离检测；设定毛细管长度、样品仓温度与检测波长，积分后统计重链、轻链峰面积占比。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

靶向抗原包被 96 孔板，4 ℃过夜孵育；PBST 洗涤后加入封闭液室温封闭 1 h；梯度稀释样品上样孵育，洗涤后加入链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶结合物显色；酶标仪读取 450 nm 吸光度值，定量检测蛋白结合活性。

结果与讨论

低分子量（-630 Da）缺陷组分的发现

抗体 mAb901 为改造型工程抗体，可同时中和两种不同的人源抗原蛋白。该抗体由靶向抗原 A 的人源 IgG 骨架，以及靶向抗原 B 的人源 IgG 可变区拼接组成。其中，抗原 A 重链的 C 端，通过5 串联 G4S 柔性连接子 [(G4S)₅]与识别抗原 B 的单链抗体片段（scFv）相连（图 1）。

双特异性抗体 mAb901 结构示意图。红线代表 G4S 连接子。

采用质谱法检测非还原态完整 mAb901 蛋白的分子量（图 2）时发现：除理论预期的目标分子量外，部分 mAb901 样品中还检测到一种低丰度组分，其分子量较理论值降低 630±2 Da，且该缺陷组分在不同样品中的占比存在差异。

肽图分析鉴定低分子量（-630 Da）缺陷组分

为鉴定该分子量缺失 630 Da 的变异体，本研究利用液质联用（LC-MS）系统，对还原处理后的双特异性抗体 A 链蛋白进行胰蛋白酶肽图解析。

mAb901 完整蛋白分子量。理论分子量为 173529 Da。图 2a 为无截短变异体的 mAb901 样品；图 2b 与图 2c 中检测到两个异常杂峰，分子量分别为 172900 Da（缺失 630 Da）与 172269 Da（缺失 1260 Da）。

图 3 为 mAb901 的肽图分析结果。利用 BiopharmaLynx 1.2 软件对质谱数据解析后，在肽图谱中发现两种低丰度未知组分，分子量缺失值分别为 630 Da 和 1260 Da。全长氨基酸序列比对结果证实：单个 G4S 连接子的分子量恰好与目标蛋白和低分子量变异体的质量差值完全吻合，且降解次级片段的质谱检测结果与肽图分子量高度匹配。

还原态 mAb901 经胰蛋白酶酶解后的肽图紫外（UV）图谱。肽图采用液质联用（LCMS）检测，紫外监测波长设置为 214 nm。图 3a 为不含截短变异体的 mAb901 样品；图 3b、3c 中可见两个异常峰，对应分子量分别为 172900 Da（缺失 630 Da）与 172269 Da（缺失 1260 Da）。

基于 DNA 测序鉴定低分子量（-630 Da）变异体

为证实 G4S 连接子的截短现象并探究其发生机制，本研究开展了 DNA 测序分析。分别对质粒、基因组 DNA 及 RNA 反转录获得的 cDNA 进行测序。cDNA 测序结果（图 4）显示，该位点存在3 个 G3S 与 4 个 G3S 连接子的混合套峰，提示连接子在此处发生序列截短，该结果与肽图分析结论一致。随后，将 PCR 产物连接至 T 载体，分别对质粒、细胞基因组 DNA 及 cDNA 样本各挑选 20 个单克隆进行测序验证（图 5）。

通过 cDNA 测序靶向鉴定序列变异。图 4a 为 cDNA 理论测序结果；图 4b、4c 显示两处非预期的序列突变。其中，图 4b 缺失 1 个 G4S 连接子重复单元，图 4c 缺失 2 个 G4S 连接子重复单元。

不同表达水平下 G4S 连接子截短差异对比

图 5a 为质粒 DNA 测序结果；而在 CHO 细胞基因组 T 载体克隆筛选（图 5b）及 CHO 细胞编码区 cDNA 样本（图 5c）中，均检测到两种序列变异体。两种缺陷型变异（黄色标注：缺失 1 个 G4S 重复单元；红色标注：缺失 2 个 G4S 重复单元）的突变比例，在基因组水平（图 5b）至转录组 cDNA 水平（图 5c）呈逐步上升趋势。

综上，三类样本各 20 个单克隆的测序结果揭示了明确规律：质粒载体层面未检测到任何连接子截短；但将该质粒转染哺乳动物细胞（HEK293、CHO）后，约 15% 的转染细胞出现非预期的 G4S 连接子截短。当整合至基因组的mAb901目的基因转录为 RNA 时，截短变异比例进一步升高至 25%。该现象可解释为：短片段 G4S 连接子的基因转录翻译负担更低，表达优势更强；在细胞分裂与单克隆筛选过程中，截短型变异体的丰度会逐步累积。

mAb901 中 G4S 连接子的优化探究

为解决 mAb901 的连接子截短问题，本研究系统评估密码子优化与G4S 连接子长度对截短效应的影响。密码子优化是抗体药物研发与蛋白表达的关键改造手段。优势密码子的合理使用可显著调控细胞内重组蛋白表达效率，该结论已在大量研究中得到验证。图 6 为不同 G4S 序列的 RNA 二级结构折叠预测；对应 DNA 序列、RNA 吉布斯自由能及局部 GC 含量详见表 1。将各组改造质粒分别转染至 HEK293 细胞与两种常用 CHO 细胞株（Sigma-Merck CHOZN、赛默飞 CHOS），各组连接子截短比例统计结果见表 2。

G4S 连接子 RNA 折叠稳定性预测。图 6a 为5G4S 连接子 1 号密码子的 RNA 二级折叠结构；图 6b 为5G4S 连接子 2 号密码子的 RNA 折叠结构；图 6c 为5G4S 连接子 3 号密码子的 RNA 折叠结构；图 6d 为 4G4S 连接子的 RNA 折叠结构；图 6e 为 3G4S 连接子的 RNA 折叠结构。

本研究委托金斯瑞生物科技对3 种不同密码子优化版本的(G4S)5​连接子进行序列优化；(G4S)4​与(G4S)3​连接子，均由 **1 号密码子版本的(G4S)5​** 序列直接截短衍生而来。各预测 RNA 二级结构旁，均标注了对应的折叠吉布斯自由能（ΔG）。所有实验均重复三次，结果趋势一致。

在 mAb901 中，将(G4S)5​连接子替换为相同密码子背景的(G4S)4​或(G4S)3​后，连接子截短现象完全消失（表 2）。研究发现：即便短链连接子仍具有较高 GC 含量、且 RNA 吉布斯自由能更低，缩短 G4S 串联重复长度仍可彻底杜绝截短变异。针对(G4S)5​的密码子优化与 GC 含量调控，无法完全消除–630 Da 与–1260 Da 缺陷变异体，仅能将截短比例由 5%~10% 降至 1%~5%。密码子优化虽可提升上游 RNA 二级结构的预测稳定性，但并不能有效防止连接子截短。

与之相反，直接缩短 G4S 连接子串联长度可从根本上解决截短问题，样品中未再检出任何–630 Da、–1260 Da 低分子量变异体。该结果证实：低重复数的短链(G4S)n​连接子不易发生序列截短。

短链 G4S 连接子版 mAb901 的功能表征

在蛋白表达层面，携带短链(G4S)n​连接子的稳定细胞株整体表达产量更高。已有研究表明，上游 RNA 二级结构的稳定性与蛋白表达量呈负相关。为验证该结论，本研究改造不同 G4S 连接子长度并构建多组稳定细胞株。产量评估结果显示：尽管(G4S)5​连接子拥有更优的吉布斯自由能、上游 RNA 二级结构稳定性更强，但 **(G4S)3​、(G4S)4​短链连接子更利于重组蛋白表达，且可完全避免截短突变 **（图 7）；各组细胞生长状态无显著差异（图 7c）。

不同 G4S 连接子长度下 mAb901 的细胞培养产量与细胞生长情况。图 7a 为不同 G4S 连接子长度细胞株在补料分批培养中的总表达产量，组间差异采用t检验进行统计学分析，***p<0.001代表差异极显著。图 7b 为不同细胞株补料分批培养中的细胞比生产速率（QP）。图 7c、7d 分别展示培养过程中的细胞密度与细胞直径变化。

缩短 G4S 连接子可完全消除 mAb901 的连接子截短问题；但对于双特异性抗体药物而言，改造后不能影响产品药效与纯度。本研究分别检测 CHOZN 与 CHOS 细胞表达样本（CHOS 数据未展示），结果显示：体积排阻色谱（SECHPLC）纯度、还原型毛细管电泳（CESDS）纯度，以及抗原 A 的 ELISA 结合活性，各组均无明显差异（图 8、图 9、图 10）。5×、4×、3× G4S 连接子样本的 SECHPLC 纯度分别为 97.0%、97.4%、97.1%，整体纯度优良；且各组主峰形态与保留时间均无显著区别。

不同 G4S 连接子长度 mAb901 的体积排阻高效液相色谱（SECHPLC）纯度检测。本图两部分坐标轴标注完全一致。

不同 G4S 连接子长度下 mAb901 的还原型 CESDS 纯度

不同 G4S 连接子长度下 mAb901 的 ELISA 结合亲和力

本研究对抗原 A 重链与抗原 B 单链抗体（scFv）进行还原型 CESDS 分析。由于抗原 B 含有 3 个 N - 糖基化位点，所有样品均预期出现两个主峰。三组样品的还原型 CESDS 纯度无明显差异，纯度分别为 96.3%、96.8% 与 96.0%。

改造 G4S 连接子时，核心顾虑之一为结合亲和力下降（部分靶点也可能出现亲和力上升）。ELISA 结合活性检测结果表明，各组间结合能力无显著差异（*p＞0.1）。上述抗体分子的体内生物学活性，有待后续动物实验进一步验证。

结论

具备双重或多重靶向功能的改造型融合蛋白（如 IgG 融合分子、双特异性抗体），已成为靶向免疫治疗领域的研究热点。G4S 连接子凭借高柔性、结构稳定、可串联多结构域与多靶向片段、抗蛋白酶降解及低免疫原性等优势，被普遍视作通用型柔性连接元件。但目前针对G4S 连接子长度的系统性研究与探讨仍较为匮乏。在部分双特异性抗体研发中，(G4S)n​连接子引发的低比例序列截短变异，会破坏批次间产品一致性，增加质量控制难度。

本研究证实：在哺乳动物细胞表达体系中，携带5 串联 G4S（n=5）的融合蛋白易产生连接子截短变异；密码子使用偏好与表达宿主细胞类型，会显著影响截短突变发生率。若要彻底根除 G4S 连接子截短问题，仍需从分子结构设计层面开展深入优化。缩短连接子长度，采用(G4S)4​、(G4S)3​等短链 G4S 元件，还可提升抗体表达产量，适用于工业化放大生产与降本研发。同时，在合理范围内减少 G4S 重复单元数量，不会损害产品纯度与抗原结合活性。

综上，研发中需综合平衡生物学活性、蛋白结构稳定性、变异体发生风险，合理评估并选择最优 G4S 连接子长度，从而提升抗体药物的表达效率、产品纯度、均一性与临床开发潜力。