摘要：类器官作为当前最具前沿性的研究方向之一，已被广泛应用于体外模拟器官发育、疾病机制解析及靶点药物筛选等领域。凭借其在结构与功能模拟方面的显著优势，类器官研究近年来得到了大量关注与报道。然而，尽管过去十年间类器官技术发展迅速，多种组织来源的类器官相继建立，该领域仍面临三大关键挑战：缺乏血管化结构、缺乏免疫细胞组分、以及器官系统化程度有限。这些问题在一定程度上限制了类器官模型的生理相关性及其在更复杂研究场景中的应用。基于最新研究文献，本文聚焦于上述“三大挑战”，探讨当前类器官研究如何寻求突破，以推动模型体系的进一步成熟与完善。
一、血管化：脑类器官模型的关键瓶颈与工程化突破
在众多类器官研究领域中，脑类器官因其临床样本的稀缺性与重要的临床应用价值而显得尤为特殊。然而，长期以来脑类器官的发展面临诸多挑战，其中最核心的问题在于其缺乏真实脑组织所具备的微环境，包括神经元回路、血管系统及免疫组分。
尤其值得关注的是血管系统。血管不仅为脑组织提供必要的营养支持，还积极参与神经细胞的分化过程。血管的缺失会导致脑类器官中心区域发生坏死，进而干扰其正常发育及神经元的迁移路径。尽管与血管干细胞的共培养在一定程度上缓解了上述问题，但营养供给与真实血液微环境的缺乏仍未得到根本解决。
一项发表于国际权威期刊Nature Methods的研究《Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system》，针对上述问题提出了工程化解决方案。该研究利用表达ETS变体2（ETV2）转录因子的人类胚胎干细胞，成功构建了具备功能性血管样结构的脑皮质类器官（命名为vhCO）。该类器官展现出类似血脑屏障的结构特征，包括紧密连接、营养转运蛋白的表达升高以及跨内皮电阻的增加，从而有效弥补了传统脑类器官缺乏血管结构的缺陷。
ETV2转录因子是机体发育过程中内皮细胞分化的关键调控基因。在该研究中，通过向培养基中添加ETV2并优化其诱导比例与时间，确定生成血管样结构的最佳条件为：20% ETV2诱导18天。免疫荧光检测结果显示，在此条件下，vhCO中显著表达内皮细胞标志物，包括CDH5、CD31、KDR、TEK、vWF及CD34。
Fig.1 Characterization of vasculature-like structures in vhCOs.
为评估vhCO中血管样结构的功能特性，研究进一步分析了不同时间点（30、70及120天）心室区样区域、室下区样区域及皮质层的分化情况。免疫荧光结果显示，vhCO与传统脑皮质类器官在管腔周围均表达SOX2（心室区标志）和TBR1（室下区标志），提示两者在大脑皮层结构的区域与形态特征上具有相似的分化程度。
同时，采用CD31分子进行整体免疫荧光染色以评估内皮与血管样网络的分布。结果发现，在第30天时，vhCO中已出现血管样结构，而传统模型中未见；至第70天时，vhCO中形成了更为复杂的血管样结构网络。上述结果表明，ETV2可成功诱导具血管样结构的脑类器官形成。
Fig.2 vhCOs demonstrate BBB characteristics.
结构与功能相辅相成。在确认血管样结构形成之后，研究进一步评估其功能特性。首先，通过灌注FITC-葡聚糖实验，证实vhCO中的血管样结构具备可灌注能力。其次，比较生长情况发现，vhCO中血管样结构具有氧气输送功能。最后，对分化神经元的分析结果显示，该类结构对神经元成熟具有关键促进作用。
Fig.3 Single-cell analysis of vhCOs.
为进一步揭示其分子机制，研究开展了单细胞测序分析，结果表明ETV2对vhCO中血管内皮细胞的成熟及血管形态发生至关重要。此外，将单细胞转录组数据与发育中人类大脑（孕周8–23周）进行比较后发现，vhCO来源的神经元对应于妊娠第16至19周的神经元发育阶段，进一步验证了其向内皮谱系分化的生物学潜力。
综上所述，该研究通过将转录因子ETV2引入脑类器官培养体系，首次构建了同时具备血管样网络结构与类血脑屏障功能的脑类器官模型，为解决脑类器官及更广泛类器官模型中血管缺失这一关键难题提供了有效策略，并推动了类器官研究的发展。
二、免疫化：基于肿瘤类器官与免疫细胞共培养的免疫反应诱导策略
免疫治疗的进展显著推动了肿瘤研究的发展。然而，由于物种特异性、人源化体系的复杂性以及免疫系统重建不完全或无效等问题，现有的免疫肿瘤模型面临诸多挑战。临床上亟需能够用于个体化疗效评估的体外模型。类器官的出现为肿瘤免疫治疗提供了新的研究平台，但当前多数类器官体系缺乏免疫细胞成分，这在一定程度上限制了其在肿瘤免疫研究中的应用。
一项发表于权威期刊Cell的研究《Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids》为解决上述问题提供了新策略。该研究通过将患者来源的自体肿瘤类器官与外周血淋巴细胞进行共培养，建立了一个能够特异性诱导并分析肿瘤免疫反应的实验平台，为分离和评估肿瘤反应性T细胞提供了新方法。
Fig.4 Co-culture of epithelial tumor organoids and peripheral blood lymphocytes
研究首先从13例错配修复基因缺陷型结直肠癌患者体内分离获得了15个肿瘤类器官，成功率为60%。随后，研究对上述类器官的特征进行了系统分析。通过全外显子组测序及免疫组织化学染色，结果显示MHC-I类分子的缺失并非该类器官的普遍特征。
Fig.5 Characterization of a Panel of dMMR CRC Organoids
为进一步评估该肿瘤类器官体系能否用于获得肿瘤特异性T细胞，研究构建了“肿瘤类器官-外周血淋巴细胞”共培养模型。具体方法为：从错配修复基因缺陷型结直肠癌患者中分离外周血单个核细胞，并每周使用自体肿瘤类器官进行刺激。通过对CD8+ T细胞效应分子IFNγ及CD107a进行染色分析，在共培养2周后评估CD8+ T细胞对肿瘤的识别能力。
结果显示，在8个MHC-I阳性的肿瘤类器官中，有4个（50%）在共培养2周后观察到IFNγ与CD107a表达上调。而在MHC-I缺陷的类器官中未观察到上述变化。此外，与类器官刺激前相比，CD8+ T细胞群体扩增了10倍。上述结果表明，该体系可用于产生并评估肿瘤特异性T细胞亚群。
Fig.6 Induction of Tumor Reactivity in Circulating T Cells by Co-culture with Autologous Tumor Organoids
进一步地，研究采用非小细胞肺癌样本对上述体系的普适性进行了验证。采用类似方法，在共培养2周后同样观察到CD8+ T细胞群体的扩增。
Fig.7 Induction of Tumor Reactivity in Circulating T Cells from Patients with NSCLC
综上所述，上述研究表明，通过将肿瘤类器官与免疫细胞进行共培养，能够有效诱导肿瘤特异性T细胞的产生。该研究拓展了类器官在肿瘤免疫研究中的应用范围，并为解决类器官体系中免疫细胞缺失的问题提供了新策略。
三、系统化：基于多类器官芯片系统模拟肝-胰岛轴的研究策略
许多疾病的发生与发展涉及多个器官系统的协同作用。传统的单一类器官模型虽能在一定程度上模拟体内单个器官的微环境，但对于涉及多系统交互的疾病，其模拟能力仍存在明显局限。因此，构建能够反映多器官协同功能的多类器官体系，成为当前类器官研究的重要发展方向。
一项发表于国际权威期刊的研究，通过构建肝脏与胰岛类器官共培养体系，成功建立了2型糖尿病的体外模型。该多类器官系统能够在生理与病理条件下模拟人类肝-胰岛轴，为2型糖尿病的发病机制研究及药物开发提供了新的实验平台。
Fig.8 Schematic of hiPSCs derived multi-organoid-on-chip system to model human liver-pancreatic islet axis in vitro.
2型糖尿病的发病率持续上升，且治疗成本高昂，显著加重了社会疾病负担。该病以高血糖和胰岛素抵抗为主要特征，通常伴随胰腺β细胞功能障碍及肝脏胰岛素抵抗。肝脏与胰岛在维持血糖稳态中发挥双重调节作用，两者的功能紊乱是2型糖尿病发生的关键因素。
目前，葡萄糖代谢与2型糖尿病的研究主要依赖动物模型，或采用原代动物肝细胞、胰岛β细胞及其细胞系组合。然而，上述模型难以准确模拟人类生理功能及代谢反应，尤其是不同器官之间的交互作用。类器官技术的出现为克服这些局限提供了新的可能性。
在该研究中，研究人员开发了一种微流控多类器官系统，用于在正常与疾病状态下研究人类肝-胰岛轴中的胰岛素与葡萄糖调节机制。为模拟体内肝脏与胰岛之间的葡萄糖调控过程，研究构建了一套包含类器官共培养芯片、蠕动泵及灌注装置的微流控系统。该芯片由平行微通道网络连接的两个隔室组成，每个隔室均设有多个微孔，用于维持肝脏与胰岛类器官的三维培养。相互连通的微通道促进了两类器官之间培养液及分泌代谢产物的交换，从而实现了肝脏与胰岛类器官的共培养。
其中，肝脏与胰岛类器官由人诱导多能干细胞在微孔阵列中诱导分化获得。通过调控培养基中添加的特定生长因子与小分子，拟胚体依次分化为内胚层细胞，并在第20天和第23天分别定向分化为肝脏谱系或胰腺谱系。随后，将分化所得的肝脏与胰岛类器官转移至芯片装置中进行长期共培养。
Fig.9 Identification of organ-specific protein and gene expressions in liver and islet organoids prior to co-culture assay.
在共培养系统构建完成后，研究分别在第0、5、11、20及23天观察了肝脏与胰岛类器官的形态与大小分布。结果显示，在诱导分化过程中，两类器官的平均尺寸逐渐增加，形态维持良好。同时，通过流式细胞术检测细胞活力，发现99.03%的肝脏类器官细胞与96.11%的胰岛类器官细胞保持良好的活力。
为进一步验证共培养类器官的功能，研究在第20天采用免疫荧光染色及实时聚合酶链反应检测肝脏特异性细胞类型与蛋白分泌情况。结果表明，人诱导多能干细胞来源的肝类器官具备药物代谢能力，并含有天然肝脏的关键细胞组分。类似地，通过免疫组织化学分析与实时聚合酶链反应证实，人诱导多能干细胞来源的胰岛类器官为包含四种内分泌细胞类型的典型多细胞组织。
Fig.10 Comparison of cell viability and functionality of liver and islet organoids under mono- and co-culture conditions.
此外，研究对该共培养系统进行了长达30天的功能评估。与单一类器官培养相比，共培养体系中的类器官在长期培养过程中表现出更高的细胞活力，并显著提升了胰岛类器官的存活率与胰岛素分泌功能。
综上所述，该研究所建立的多类器官芯片系统为研究多器官疾病的发生机制提供了新策略，弥补了单一类器官模型难以模拟多系统相互作用的不足。同时，该研究也展示了整合不同技术手段以丰富类器官培养体系的重要发展方向。
四、总结：类器官研究的三大挑战与未来展望
综上所述，在过去十年间快速发展的类器官研究领域，其所面临的“血管化、免疫化、系统化”三大核心挑战，已有不同研究团队提出并探索了多种解决方案。尽管现有研究策略尚不完善，相关技术路径仍需进一步优化，但这些成果为类器官研究的持续突破提供了新的思路与可能性。
应当意识到，类器官研究仍存在诸多有待解决的科学与技术问题。然而，全球范围内不断涌现的学术进展表明，这些难题正被逐步攻克。无论最终采用何种解决方案，整个领域的发展都离不开稳定、高效且高质量的试剂支持。
