摘要：本文基于杂交瘤技术，完整实现布鲁氏菌 Bp26 蛋白单克隆抗体制备，并完成抗体亚类、特异性、敏感性、稳定性等生物学鉴定，提供可复现的实验流程、参数与结果，为生物研发人员提供技术参考。
1 实验背景与目的
布鲁氏菌 Bp26 蛋白为保守性免疫原蛋白，是疫病检测的关键靶标。本实验旨在制备高特异性、高稳定性的 Bp26 蛋白单克隆抗体，建立标准化制备流程，为后续检测方法建立提供核心原料。
2 实验材料与仪器
实验动物：BALB/c 小鼠；细胞株：骨髓瘤细胞；试剂：弗氏佐剂、PEG1450、HAT 培养基、ELISA 试剂盒等；仪器：酶标仪、电泳仪、层析系统、细胞培养箱等。
3 Bp26 重组蛋白表达与纯化
3.1 重组质粒构建：将 Bp26 基因克隆至 pET 系列载体，转化后酶切鉴定，测序确认序列正确。3.2 蛋白诱导表达：将重组质粒转化至 BL21 (DE3) 菌株，37℃培养至 OD600=0.6-0.8，加入 IPTG 诱导，优化诱导条件实现高效表达。3.3 蛋白纯化：收集菌体超声破碎，离心取上清，通过镍亲和层析柱纯化，洗脱液超滤浓缩，SDS-PAGE 检测纯度，BCA 法测定浓度。
结果：获得高纯度 Bp26 重组蛋白，无明显降解，浓度满足免疫需求。
4 动物免疫
选取健康小鼠，分为免疫组与对照组，免疫组按 0d、21d、35d、49d 进行免疫，抗原剂量 50μg / 只，首次免疫用完全佐剂，后续用不完全佐剂，末次免疫后 7d 采血测效价。
结果：免疫小鼠血清抗体效价显著高于对照组，达到细胞融合要求。
5 细胞融合与杂交瘤细胞筛选
5.1 细胞融合：取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞按 5:1 比例混合，37℃加入 PEG 融合 2min，缓慢加入培养基终止融合，离心重悬。5.2 选择性培养：融合细胞接种于 96 孔板，HAT 培养基培养 7d，换 HT 培养基继续培养。5.3 阳性克隆筛选：采用间接 ELISA，包被浓度 1μg/mL，上清 1:10 稀释，以 OD450 值≥2.1 倍阴性对照为阳性判定标准。5.4 亚克隆：阳性孔采用有限稀释法，连续 3 次亚克隆，获得单克隆细胞株。
结果：成功获得多株稳定分泌抗 Bp26 蛋白单抗的杂交瘤细胞株。
6 单克隆抗体生物学鉴定
6.1 抗体亚类鉴定：使用试剂盒测定，结果为 IgG2a 型，轻链 κ 型。6.2 特异性鉴定：与对照蛋白进行 ELISA 检测，无交叉反应，特异性良好。6.3 敏感性鉴定：抗原梯度稀释，抗体最低检测限达到 ng 级水平。6.4 稳定性鉴定：细胞株连续传代 15 代，上清效价无显著下降，稳定性优异。6.5 免疫学活性鉴定：Western Blot 显示抗体可特异性结合目的蛋白，条带清晰。
7 抗体批量制备与纯化
采用小鼠腹腔诱生腹水法，预处理小鼠后注射杂交瘤细胞，收集腹水，经辛酸 - 硫酸铵沉淀法纯化，Protein G 柱进一步精制，纯化后抗体纯度 > 95%，活性符合使用要求。
8 技术关键点与问题解决
8.1 融合效率低：优化 PEG 浓度与融合时间，控制细胞状态，提升融合成功率。8.2 非特异性结合：优化包被浓度、封闭液与洗涤条件，降低背景值。8.3 细胞株不稳定：增加亚克隆次数，早期冷冻保存，避免细胞变异。
9 实验结论与技术价值
本实验成功建立布鲁氏菌 Bp26 蛋白单克隆抗体制备技术体系，制备的抗体各项指标优异，可用于免疫检测方法开发。该流程参数明确、可复现性强，适用于生物公司研发与实验室研究，可推广至其他蛋白单抗制备项目。
10 后续研发方向
基于本抗体优化快速检测试纸条；建立定量检测 ELISA 方法；开展抗体人源化改造，拓展应用场景；优化大规模纯化工艺，降低生产成本。
参考文献：罗意，马春慧，郑福英，等。布鲁氏菌 Bp26 蛋白单克隆抗体制备及生物学鉴定 [J]. 中国农业大学学报，2025, 30 (7): 139-149.
